Aplicación de ASL de múltiples bolos ponderados por difusión a un modelo murino de tripanosomiasis africana humana

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8684 (2023) Citar este artículo

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La tripanosomiasis africana humana (HAT) es una enfermedad parasitaria originaria del África subsahariana. Hay información limitada sobre los cambios en la barrera hematoencefálica (BBB) durante esta infección. Este estudio es el primero en aplicar ASL ponderado por difusión (DWASL) para examinar los cambios en el deterioro de BBB. No se encontraron cambios significativos en el intercambio de agua a través de la BBB durante la infección, incluso cuando se observó una pérdida de la integridad de la barrera mediante resonancia magnética mejorada con contraste (Gd-DTPA) durante la última etapa de la enfermedad. Además, utilizando múltiples boli ASL (mbASL), se encontraron cambios en el flujo sanguíneo cerebral (CBF) durante el curso de la infección. En general, este estudio destaca la necesidad de un mayor estudio de la BBB durante la infección HAT para comprender los complejos mecanismos detrás del deterioro.

La Tripanosomiasis Humana Africana (HAT), también conocida como Enfermedad del Sueño, es una enfermedad parasitaria originaria del África subsahariana. La enfermedad es causada por la infección con los parásitos protozoarios Trypanosoma brucei gambiense (T. b. gambiense) o Trypanosoma brucei rhodesiense (T. b. rhodesiense), que se transmite por la picadura de la mosca tsetsé1. Ambas cepas de la enfermedad pueden ser fatales si no se diagnostican y tratan con quimioterapia. La mayoría de los casos de HAT, aproximadamente el 97%, provienen de T. b. gambiense, con el otro 3% causado por T. b. Rhodesiense. T. b. gambiense se encuentra principalmente en África occidental y puede durar varios años antes de morir, mientras que T. b. rhodesiense es una infección aguda que se encuentra en el este de África y dura de semanas a meses2. La enfermedad se puede clasificar en dos etapas después de la infección: la etapa temprana o hemolinfática y la etapa tardía o encefalítica. En la etapa inicial, el parásito prolifera en la sangre, los ganglios linfáticos y los órganos principales, como el bazo, los riñones y el hígado. La etapa tardía ocurre cuando el parásito ha cruzado la barrera hematoencefálica (BBB) y se ha establecido en el sistema nervioso central (SNC).

La barrera hematoencefálica desempeña un papel crucial en el sistema nervioso central (SNC) al mantener la homeostasis del cerebro y regular el intercambio entre la sangre y el cerebro3. El método por el cual los parásitos se infiltran en el SNC actualmente no se comprende completamente, pero se sabe que los tripanosomas están presentes en el cerebro durante la infección4. Los estudios han examinado la relación entre los tripanosomas en el cerebro y el deterioro de la barrera5,6, pero no se ha encontrado ninguna correlación. Un estudio de Philip et al.6 mostró un deterioro creciente de la BBB en áreas localizadas utilizando un tinte fluorescente en las últimas etapas de la infección, pero la presencia de tripanosomas no se correlacionó con estas áreas. Otro estudio de Mulenga et al.7 mostró además la complicada relación entre la BBB y los tripanosomas. En un modelo de rata de HAT, la tinción con ocludina y ZO-1 no sugirió daño a la integridad de las uniones estrechas, pero se detectaron tripanosomas en el cerebro.

Hay una respuesta neuroinflamatoria cuando la enfermedad entra en la etapa tardía donde hay presencia de células inflamatorias que incluyen macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. Estas células infiltran las meninges, con mayor inflamación de los vasos parenquimatosos y, finalmente, encefalitis. Además, hay activación de astrocitos y células microgliales. Los astrocitos, que brindan apoyo a las células endoteliales, ayudan a facilitar el cruce de agua hacia el cerebro, debido a los canales AQP4 en los extremos de los pies de los astrocitos. Se ha descubierto que estas proteínas juegan un papel importante en el paso del agua al tejido cerebral8,9.

El deterioro de la BBB se encuentra en muchas enfermedades neurológicas importantes, incluidos los accidentes cerebrovasculares, el cáncer, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple. El estándar de oro actual para obtener imágenes del deterioro de BBB in vivo es la resonancia magnética mejorada con contraste (CE-MRI). Mediante la inyección intravenosa de un agente de contraste, generalmente a base de gadolinio (Gd-DPTA), el deterioro de la BBB puede examinarse mediante una serie de imágenes potenciadas en T1. El agente de contraste no puede cruzar una BBB intacta, pero puede cruzar una barrera deteriorada, lo que da como resultado una señal hiperintensa en las imágenes potenciadas en T1. CE-MRI se puede utilizar para detectar cambios de moderados a severos en la integridad de la barrera, pero carece de la sensibilidad para detectar cambios sutiles, por ejemplo, como se ve en estudios de demencia, accidente cerebrovascular agudo e invasión de glioma10,11,12. Además, investigaciones recientes han informado problemas de depósito de gadolinio en el cuerpo13,14,15, lo que plantea interrogantes sobre el uso clínico continuado de agentes de contraste exógenos. Investigaciones anteriores han examinado los cambios de BBB en ratones infectados con HAT mediante el uso de CE-MRI16. Rogers et al. encontró una diferencia significativa en la mejora de la señal desde el día 14 después de la infección. Además, esta mejora de la señal aumentó el día 21 y el día 28 después de la infección5, lo que indica un mayor deterioro de la barrera a medida que la enfermedad avanza desde la etapa temprana hasta la tardía.

El marcaje de espín arterial (ASL) es una técnica de RM no invasiva que se puede utilizar para medir el flujo sanguíneo cerebral (FSC). Al utilizar el agua de la sangre arterial como trazador endógeno, se pueden adquirir imágenes ponderadas de perfusión, que se pueden convertir en mapas de CBF utilizando un modelo cinético adaptado. El agua de la sangre se etiqueta en la región del cuello a medida que viaja hacia el cerebro antes de tomar una imagen. Se toma otra imagen sin este etiquetado y la resta de las dos imágenes proporciona la ponderación de la perfusión. Hay dos tipos principales de ASL, a saber, ASL pulsado (PASL) y (pseudo-) ASL continuo (pCASL/CASL). ASL tiene una SNR inherentemente baja y se han desarrollado e implementado múltiples secuencias tanto clínica como preclínicamente para intentar aumentar la SNR y mejorar las imágenes de ASL17,18,19. Un método ASL recientemente desarrollado, múltiples boli ASL (mbASL), utiliza un tren de pulsos adiabáticos para etiquetar la sangre arterial. Cuando se comparó mbASL con la secuencia PASL FAIR estándar en escáneres preclínicos, mostró una SNR20 más alta. Para la creación de mapas CBF usando mbASL, se ha desarrollado un modelo de cuantificación basado en el modelo Buxton PASL2122.

ASL ponderado por difusión (DWASL) es una secuencia de RM emergente que combina ASL con un par de gradientes de difusión23,24. Esta combinación permite que la señal de ASL se separe en agua de sangre etiquetada que permanece en las arteriolas/capilares (intravascular) y agua de sangre etiquetada que se ha intercambiado a través de la BHE hacia el parénquima cerebral (extravascular). DWASL se ha aplicado a varias afecciones neurológicas, como la apnea del sueño25, el accidente cerebrovascular isquémico26 y los tumores cerebrales24. La técnica permite el sondeo de 'pseudo-permeabilidad'. La BBB puede considerarse un material poroso permeable debido a que las células endoteliales tienen uniones estrechas entre ellas. La definición tradicional de permeabilidad es la Ley de Darcy,

donde el caudal (q) de un fluido (viscosidad, µ) a través de un medio poroso (longitud, L) se debe a un diferencial de presión (\(\Delta P).\) Aquí, la permeabilidad (k) es la constante de proporcionalidad determinación del caudal. Claramente, una medida directa de la permeabilidad de BBB no es posible. Sin embargo, la tasa de intercambio de agua a través de la BBB, determinada por DW-ASL, puede usarse como una medida de pseudopermeabilidad, donde, por ejemplo, un aumento en la permeabilidad se asociará con un mayor intercambio de agua.

En este estudio, fuimos los primeros en aplicar ASL y DWASL para examinar el deterioro de BBB en HAT utilizando un modelo murino bien establecido de la enfermedad. El estudio explora los cambios en el intercambio de agua a través de la BBB y mide el CBF durante el curso de la infección por primera vez, comparando los resultados con la resonancia magnética mejorada con contraste. En general, el estudio tuvo como objetivo investigar los cambios en el intercambio de agua observados en varios momentos durante el curso completo de la infección por HAT.

Todos los experimentos fueron aprobados por la junta de revisión de ética local de la Universidad de Glasgow y la Ley de animales del Ministerio del Interior del Reino Unido (Procedimientos científicos) de 1986. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes. El estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE. Una T. b. bien establecida. brucei GVR35 modelo de ratón de tripanosomiasis africana humana se utilizó para este estudio. Los experimentos se realizaron con un grupo de 38 ratones hembra CD-1, con un peso corporal de 30 a 38 g. Todos los animales procedían de Charles River Lab. Los ratones se dividieron en tres grupos de n = 6 y dos grupos de n = 8, y los ratones restantes se usaron para el paso inicial del parásito para facilitar la infección de los grupos experimentales. Un grupo de seis animales no estaba infectado y actuó como grupo de control. Los cuatro grupos restantes se infectaron mediante inyección intraperitoneal con 2 × 104 tripanosomas en 100 μL de glucosa salina tamponada con fosfato (PBSG). Los ratones se escanearon los días 7 (n = 6), 14 (n = 6), 21 (n = 8) y 28 (n = 8). Para los días 21 y 28, se utilizó n = 8 para permitir que los ratones sucumbieran a la infección antes de la sesión de exploración. Después de la resonancia magnética, se sacrificó a los ratones y se extirparon sus cerebros, se fijaron en formalina tamponada neutra al 4% y se procesó la cera de parafina para el análisis histológico. Se determinaron los tamaños de los grupos, utilizando el resultado de experimentos previos, para permitir suficiente poder estadístico al investigar la gravedad de la respuesta neuroinflamatoria y para garantizar el éxito de CE-MRI en un mínimo de 3 ratones. La información sobre el resultado de cada animal se puede encontrar en la Tabla 1.

Los experimentos se realizaron en un sistema horizontal Bruker PharmaScan Avance III de 7 T (300 MHz). Se utilizó un inserto de gradiente de imágenes Bruker BGA9 (300 mT m-1) para proporcionar pulsos de gradiente de campo magnético lineal. Se usó un resonador de volumen de radiofrecuencia (RF) de jaula de pájaros de 72 mm para transmitir, y una bobina de cabeza de superficie solo receptora de matriz en fase de cuatro canales de 22 mm se usó para detectar la señal. Para la exploración, los animales se anestesiaron en una cámara con isoflurano al 5 % y una proporción de O2/N2O de 30:70 antes de transferirlos al escáner de resonancia magnética y mantenerlos con isoflurano al 2-3 %.

Se aplicó una secuencia de mbASL ponderada en difusión con los siguientes parámetros: CI = 5000 ms, TR = 7000 ms, TI = 50 ms, TE = 27,3 ms, número de pulsos (np) = 20, Número de promedios (NA) = 10, matriz = 96 × 96, FOV = 2,5 × 2,5 cm. Las imágenes se adquirieron con un módulo de secuencia EPI spin-echo de disparo único. El grosor de la losa de etiquetado y la losa de imágenes fue de 10 mm y 1 mm respectivamente, con valores b de 0, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500 s/mm2 utilizados para la codificación de difusión. El gradiente ponderado por difusión se aplicó en la dirección x. Los datos en los que b = 0 s/mm2 se extrajeron para analizarlos como datos de mbASL.

Para el cálculo de los mapas CBF, se adquirió un mapa T1 para cada animal, utilizando una secuencia EPI de un solo disparo de eco de espín de recuperación de inversión, TR = 10.000 ms, TR = 28,1 ms, NA = 1, tiempo de exploración = 2 m 40 s . Los tiempos de TI variaron de 25 a 7000 ms con un incremento incremental de 400 ms para dar 16 puntos diferentes.

Para la resonancia magnética mejorada con contraste, se utilizó una secuencia potenciada de relajación de adquisición rápida mejorada (T1-RARE) ponderada en T1 con los siguientes parámetros: FOV = 17,6 × 17,6 mm, TE = 12,28 ms, TR = 916 ms, espesor de corte = 1,0 mm, tamaño de matriz = 176 × 176, factor raro = 4, FT parcial = 1,6, NA = 8, tiempo de exploración 3 min 17 s. Se tomó un solo corte de imágenes en el centro del cerebro. La secuencia T1-RARE se realizó antes y después de la inyección de 0,1 mL de solución que contenía 50 μL de gadolinio-dietilentriamina ácido pentaacético 0,5 mmol/mL (Gd-DPTA; Magnevist, Bayer) y 50 μL de agua estéril a través de una cánula en la vena de la cola. Después de un retraso de cinco minutos para permitir que el agente de contraste viajara al cerebro, se repitió el T1-RARE.

Todo el procesamiento y análisis de las imágenes se realizó utilizando el código interno de MATLAB (Mathworks, Inc). Los datos se transfirieron de Paravision 5.1 a MATLAB a través del formato DICOM.

Las imágenes obtenidas en cada escaneo se separaron en imágenes de etiquetas y de control, se promediaron para cada valor b y luego se restaron por pares para crear diez imágenes ponderadas por perfusión (donde \(\Delta M\), representa este cambio en la señal). Se tomaron regiones de interés (ROI) del cerebro completo y de la región de la corteza. Las señales \(\Delta M\) medias se ajustaron a un modelo biexponencial como se describió anteriormente24

donde \(\Delta M(0)\) es la señal en b = 0, Acap y Atis son factores de ponderación que representan la fracción de los componentes de señal intravascular (capilar) y extravascular (tejido) de la curva de señal, respectivamente. Dcap y Dtis son los coeficientes de difusión aparente (ADC) para el agua intravascular y extravascular respectivamente. La estimación de la pseudopermeabilidad se realizó usando imágenes en dos valores b de 0 y 75 s/mm2, con base en trabajos previos, utilizando la suposición de un ATT similar en las regiones del cerebro debido a una distribución uniforme de la señal en el cerebro y en todo el grupos experimentales27. Las señales de cada vóxel se dividieron y trazaron usando una escala de cero a uno.

Los mapas de CBF cuantitativos (unidades: ml/100 g/minuto) se calcularon usando la señal de los datos de mbASL, que se encuentra extrayendo los datos de b = 0 s/mm2 de los conjuntos de datos de DWASL (\(\Delta {M}_{ mbASL}\)) y el nuevo modelo cinético mbASL22 basado en el modelo cinético de Buxton21

donde la magnetización en el pulso np se calcula como:

Con \(\Delta {M}_{i}(t)\) la señal para un solo pulso, Mb0 la magnetización inicial, \(\tau\) es la duración de la llegada de la sangre marcada (0.45), \(\ alpha\) es la eficiencia de marcaje (0,95) y \(\delta\) el tiempo de tránsito arterial (150 ms). El T1 del tejido cerebral se obtuvo del mapa T1 adquirido en cada experimento y el T1b se fijó en 2,1 s.

Los mapas de mejora del contraste se generaron a partir de las imágenes ponderadas en T1 utilizando la siguiente ecuación:

donde Spre es la señal del agente de precontraste y Spost es la señal del agente de poscontraste. La señal media para cada corte de cerebro se calculó seleccionando el área completa del cerebro como ROI y promediando la señal.

La respuesta inflamatoria de la neuroinflamación se midió como se describió previamente28. Cada sección del cerebro se clasificó evaluando la gravedad de la meningitis, la aparición de manguitos perivasculares y el grado de infiltración de células inflamatorias del parénquima cerebral.

Todos los valores se expresan como valor medio ± desviación estándar. El análisis estadístico de la señal DWASL, los valores del mapa CBF y los mapas de mejora de la señal se realizaron utilizando Minitab 17 (Minitab inc). Se utilizó el modelo lineal general (GLM) para investigar las diferencias entre las medias de los grupos de ratones a lo largo del experimento utilizando el análisis de varianza de bloques aleatorios (ANOVA) y la prueba de comparación de Tukey. Se consideró significación estadística para valores de p < 0,05. Los factores de ponderación para cada curva de señal DWASL se compararon entre los puntos de escaneo utilizando un modelo lineal general, con una diferencia significativa establecida en intervalos de confianza del 5 % y el 95 %. Se aplicó el mismo modelo analítico a los valores de CBF calculados en cada punto de tiempo.

Se produjeron imágenes de mbASL ΔM de alta calidad para cada ratón (Fig. 1a). No se observaron cambios cualitativos entre las imágenes ΔM en cada punto de tiempo. Los mapas CBF se produjeron como se describe en los métodos (Fig. 1b). El valor medio de FSC del cerebro antes de la infección fue de 156 ± 30 ml/100 g/min. Esto no fue significativamente diferente de cualquier otro grupo (p> 0,05). La Figura 2 demuestra la diferencia en los valores de CBF en cada punto de infección. Se observó una disminución no significativa después de la infección en comparación con todos los puntos de tiempo de infección. Se observó un aumento en el FSC el día 28 (220 ± 63 ml/100 g/min) que fue significativamente diferente a los días 7, 14 y 21 después de la infección (135 ± 5, 121 ± 33, 145 ± 44 ml/100 g/min). min respectivamente) (p < 0,05). Estos cambios se observaron tanto en la corteza como en todo el cerebro.

Una imagen mbASL, el mapa CBF correspondiente y el mapa de pseudopermeabilidad para un ratón de cada grupo de infección. (a) Las imágenes de mbASL para cada ratón demostraron la alta señal/ruido de mbASL, con detalles que muestran claramente la corteza. Estas imágenes no mostraron diferencias cualitativas en ningún punto de la línea de tiempo del estudio cuando se compararon. ( b ) Los mapas CBF se produjeron utilizando el modelo cinético mbASL. Se encontró una media de 156 ± 11 mL/100 g/min para el grupo no infectado. (c) Se produjeron mapas de pseudopermeabilidad tomando la relación de dos imágenes en b = 0 y 0 y 75 s/mm2. Los ROI de la corteza y el cerebro completo mostraron valores similares para todos los puntos temporales de infección sin que se observaran diferencias significativas (p > 0,05).

Demostración del rango de valores de flujo sanguíneo cerebral visto a lo largo del estudio. Se encontró un valor medio de 156 ± 11 ml/100 g/min en el cerebro completo de los ratones no infectados. Luego se observa una disminución no significativa en el FSC medio después de la infección, hasta un aumento en la última etapa de los días 21 y 28 después de la infección. Se observa una diferencia significativa (p < 0,05) entre el día 28 y los días 7, 14 y 21 posteriores a la infección. No se observa una diferencia significativa entre el d28 y el grupo no infectado (p = 0,063). La importancia se denota por el * y la línea sobre los pares apropiados. Los valores atípicos se indican con +.

La Figura 3 demuestra la curva de atenuación de la señal para cada grupo de ratones, donde la señal ΔM se ha ajustado a un modelo biexponencial. El decaimiento rápido de la señal, atribuido al componente capilar intravascular de la sangre marcada Dcap, se puede ver en valores b bajos, con el decaimiento lento de la señal del tejido extravascular, Dtis, visto en valores b más grandes. La señal de la imagen de control del par DWASL se trazó como comparación, en este caso no se ha producido el etiquetado pero la difusión aún está presente. Se realizaron comparaciones entre el coeficiente de ajuste de Acap en todos los grupos. Para el grupo no infectado, Acap = 0,101 que luego aumentó a Acap = 0,12, 0,13, 0,16 y 0,18 en los días 7, 14, 21 y 28, respectivamente, sin embargo, no hubo diferencia significativa entre estos valores (p > 0,05). Se encontró un valor de 7,9 × 10–4 mm2/s para Dtis para los ratones del grupo no infectado, con valores de Dtis = 7,1, 7,2, 7,0 y 6,8 × 10–4 mm2/s en los puntos temporales de infección. No hubo diferencia significativa entre estos valores. Se encontró que el componente intravascular Dcap era 100 veces mayor que el del componente tisular, con Dcap = 3,5 × 10–2 mm2/s para el grupo no infectado y Dcap = 3,8, 2,4, 2,0 y 2,3 × 10–2 mm2/ s en los días 7, 14, 21 y 28, respectivamente. Se realizó una comparación adicional mediante el uso de mapas de pseudopermeabilidad (Fig. 1c), con una relación tomada de cada imagen en b = 0 y 75 s/mm2. Se encontró un valor de pseudopermeabilidad de 0,73 ± 0,03 para el grupo no infectado en el cerebro completo. No se encontraron diferencias significativas en la pseudopermeabilidad entre ninguno de los grupos, con valores que oscilan entre 0,69 y 0,73. Se encontraron resultados similares para la región de la corteza, con un rango de 0,71 a 0,76. Los valores para los valores de ajuste y los coeficientes de difusión se pueden ver en la Tabla 2.

La señal DWASL para cada momento de infección se ajusta a un modelo biexponencial y se representa gráficamente entre b = 0 y 300 s/mm2. La señal de la imagen de control del grupo no infectado, donde no hay etiquetado, se traza como comparación. Hay una fuerte caída en el ΔM en los valores bajos de b antes de que la señal tienda a la caída más lenta de la señal de control. La comparación de la constante de ajuste Acap no mostró diferencias significativas entre ninguno de los puntos.

CE-MRI se realizó en tres animales de cada grupo. La potenciación de la señal T1 se determinó en un 7 ± 3 % para el grupo no infectado. La mejora de la señal T1 en los días 7 y 14 no cambió significativamente con respecto al grupo no infectado (p = 0,83 y p = 0,31). Se encontró una diferencia significativa en los puntos de tiempo de la última etapa, con un aumento de la señal T1 de 25 ± 9 % (p = 0,028) y 19 ± 7 % (p = 0,044) para los días 21 y 28 después de la infección, respectivamente (Fig. 4) . En los puntos de tiempo de la última etapa, se encontró un deterioro de la barrera en múltiples regiones del cerebro (Fig. 4A).

Mapas de mejora de contraste y análisis estadístico de datos. (A) Un mapa de mejora de la señal de un ratón en cada grupo de experimentos. La mejora se puede ver desde el día 14 pi en adelante, con señal detectada en múltiples regiones del cerebro. (B) La comparación de los valores de mejora de la señal encontró una diferencia significativa (p < 0,05) en la mejora entre el grupo no infectado y los días 21 y 28 pi. También hubo una diferencia significativa (p < 0,05) entre el día 7 y el día 21 y 28 pi.

La reacción inflamatoria de los cerebros de los ratones infectados para cada grupo se puntuó utilizando una puntuación de clasificación neuropatológica28.

Todos los grupos infectados tuvieron una puntuación significativamente diferente a la del grupo no infectado (p < 0,05). Se encontró una puntuación de 0,5 ± 0 el día 7, 0,58 ± 0,08 el día 14, 2 ± 0 el día 21 y 1,75 ± 0,17 el día 28 después de la infección. La tinción H&E realizada en cada punto de infección encontró una meningitis leve el día 14 después de la infección (Fig. 5), y la gravedad de la enfermedad aumentó el día 28 después de la infección. En este punto, la enfermedad se encontraba en la última etapa, con infiltración celular inflamatoria moderada en las meninges, un aumento en el número de células alrededor de los vasos y manguitos perivasculares alrededor de los vasos en el hipocampo.

Tinción H & E de secciones de cerebro. Las muestras se tomaron antes de la infección (A, B), el día 14 (C, D) y el día 28 después de la infección (E, F). En el día 14 después de la infección, se observa una meningitis leve (flecha negra) con un manguito perivascular leve (flecha azul) alrededor de algunos vasos. En el día 28 después de la infección, tanto la meningitis (flecha negra) como los manguitos perivasculares (flechas azules) son más prominentes.

Este es el primer estudio que examina los cambios en el intercambio de agua y el flujo sanguíneo cerebral en el cerebro infectado con HAT. Estudios previos han demostrado el deterioro de la BBB después de la infección, utilizando CE-MRI con un agente de contraste basado en gadolinio (Gd-DTPA)5,16,29. Sin embargo, como la CE-MRI solo es sensible a la BBB moderada y grave, decidimos investigar el uso de DWASL como alternativa a la CE-MRI. Se planteó la hipótesis de que cuando ocurriera el deterioro de BBB, habría un aumento correspondiente en la permeabilidad de la barrera al agua. Se ha demostrado previamente que DWASL es sensible a los cambios en el intercambio de agua24,25,26,27 y se ha utilizado para examinar la permeabilidad de la BBB durante la enfermedad. Por lo tanto, se usó DWASL para examinar los cambios en el intercambio de agua a través de la BBB en diferentes momentos posteriores a la infección.

Al ajustar los datos de DWASL a un modelo biexponencial, se puede separar la señal de los compartimentos intravascular (capilar) y extravascular (tejido). El rango de valores de Dtis informado en este estudio es consistente con hallazgos similares en la literatura9. La comparación de Dcap y Acap entre los grupos no encontró diferencias significativas en ningún momento, lo que indica que puede que no haya cambios significativos en el intercambio de agua entre ratones infectados y no infectados. Este resultado fue inesperado, ya que las mediciones de CE-MRI mostraron un aumento significativo en la mejora de la señal de Gd-DPTA en los días 21 y 28 posteriores a la infección, lo que indica un deterioro sustancial de BBB. Esto indica que los cambios inducidos por HAT en la BBB son más complejos de lo que se pensaba inicialmente. El aumento en la mejora de la señal de Gd-DPTA sugiere un deterioro de las uniones estrechas, ya que Gd-DPTA (938 Da) no puede cruzar una BHE intacta. Esto genera más preguntas ya que este deterioro no conduce a un mayor intercambio de moléculas de agua más pequeñas (18 Da) y necesita más investigación.

En otros modelos de enfermedades, se ha demostrado que el deterioro de la BBB conduce a un mayor intercambio de agua a través de la BBB30,31. Como este no es el caso con HAT, esto nos lleva a especular que hay otros factores en juego. Por ejemplo, las moléculas de agua, a diferencia de las moléculas de Gd-DTPA, pueden transportarse al intersticio a través del canal de agua astroglial acuaporina-4 (AQP4). Aunque se han realizado investigaciones sobre otros canales de Aquaporin en relación con HAT (por ejemplo, AQP2 al observar la administración de fármacos a través de BBB32,33), ninguna investigación ha explorado los efectos de AQP4 en BBB en HAT. Aunque este estudio no investigó AQP4 directamente, los resultados sugieren fuertemente que la expresión de AQP4 debe investigarse más a fondo para comprender los complejos mecanismos de la BBB. Un estudio reciente realizado por Ohene et al.9 usando un método similar a DWASL, conocido como multi TE-ASL, encontró que el tiempo de intercambio de agua en ratones knockout para AQP4 se redujo significativamente en comparación con los ratones normales. Por lo tanto, puede ser valioso investigar el papel de AQP4 en la infección por HAT.

El análisis histológico del cerebro encontró una neuroinflamación de leve a moderada en los ratones infectados mediante la tinción H & E. Esto es consistente con estudios previos que utilizaron este modelo GVR-35 de HAT5,16. La inflamación aumentó a medida que la enfermedad entró en la última etapa, con células inflamatorias encontradas en las meninges y el manguito perivascular de los vasos. Curiosamente, la inflamación más alta se encontró el día 21 después de la infección con un grado de 2, en comparación con un grado de 1,75 en el día 28. Esto es consistente con los hallazgos de la CE-MRI, donde se encontró el aumento de señal T1 más alto en el día 21 post infección.

Este estudio fue el primero en examinar el flujo sanguíneo cerebral en HAT usando la secuencia recientemente desarrollada mbASL, se encontró un valor de CBF de 156 ± 11 mL/100 g/min en el grupo no infectado, consistente con los valores de CBF en la literatura17,18, 19,34. Estos resultados fueron interesantes ya que hubo una diferencia significativa entre el día 28 posterior a la infección y los días 7, 14 y 21, pero no entre el día 28 y el grupo no infectado. La misma tendencia se encontró en la región de la corteza. Como este es el único estudio hasta la fecha que explora estos cambios, se necesita más investigación para comprender los mecanismos detrás de los cambios encontrados. Para este experimento, asumimos que hubo un cambio mínimo en el CBF inicial en el transcurso de un mes35 y no incluimos un grupo de control separado porque sería innecesario. Las condiciones en las que se llevó a cabo el experimento se mantuvieron lo más estables posible, como se describe en la sección "Métodos".

El estudio DWASL actual aplicó el gradiente de difusión en una sola dirección, a lo largo del eje x. Los estudios futuros podrían mejorar esto aplicando el gradiente de difusión en múltiples direcciones, lo que significa que la complejidad del sistema capilar no impide la supresión total de la señal intravascular. Por ejemplo, un estudio de Wells et al.23 aplicó DWASL en tres direcciones para investigar estos complejos patrones de flujo microvascular y demostró que se puede encontrar más información sobre el flujo capilar cuando se utiliza este enfoque.

En conclusión, la aplicación exitosa de DWASL a un modelo murino de HAT ha demostrado que no hay una diferencia significativa en el intercambio de agua a través de la BBB durante la infección, incluso cuando hay una mejora de la señal T1 de Gd-DTPA. Dado que la CE-MRI con Gd-DPTA solo es sensible para el deterioro de la BBB de moderado a grave, llama la atención que no se observaron los cambios correspondientes en la permeabilidad al agua de la BBB. Este estudio demuestra que se necesita más investigación sobre los complejos procesos de deterioro de BBB durante la infección HAT, con el papel de AQP4 en BBB y HAT identificado para una mayor exploración.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores desean agradecer al Sr. James Mullin, la Sra. Linda Carberry y la Sra. Lindsay Gallagher por su ayuda en la preparación y exploración de los ratones. SP desea agradecer la financiación de su beca de doctorado de la EPSRC ((EP/M508056/1).

Instituto de Ingeniería Médica y Biológica, Escuela de Ingeniería Mecánica, Universidad de Leeds, Leeds, Reino Unido

samantha paterson

Centro de resonancia magnética experimental de Glasgow, Instituto de Neurociencia y Psicología, Universidad de Glasgow, Glasgow, Reino Unido

Samantha Paterson, Antoine Vallatos y William M. Holmes

Instituto de Biodiversidad, Salud Animal y Medicina Comparada, Facultad de Ciencias Médicas, Veterinarias y de la Vida, Universidad de Glasgow, Glasgow, Reino Unido

jean rodgers

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SP desarrolló la investigación, realizó los experimentos y el análisis posterior, escribió el texto principal del manuscrito y preparó las figuras. AV desarrolló las secuencias de RM con WMH y desarrolló el análisis con SPJR, desarrolló y proporcionó el modelo in vivo, ayudó con los detalles asociados con los animales y realizó el análisis histológico. WMH adquirió la financiación del proyecto, desarrolló el estudio, las secuencias de RM y ayudó con los parámetros experimentales. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a William M. Holmes.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Paterson, S., Vallatos, A., Rodgers, J. et al. Aplicación de ASL de múltiples bolos ponderados por difusión a un modelo murino de tripanosomiasis africana humana. Informe científico 13, 8684 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34665-z

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Recibido: 12 Abril 2022

Aceptado: 05 mayo 2023

Publicado: 29 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34665-z

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