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Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 217 (2023) Citar este artículo

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La mecánica tisular determina la homeostasis tisular, el desarrollo y la progresión de la enfermedad. La vejiga depende en gran medida de sus propiedades mecánicas para realizar su función fisiológica, pero estas se revelan mal en condiciones normales y patológicas. Aquí caracterizamos las huellas dactilares mecánicas a nivel de microescala de las tres capas de tejido que componen la pared de la vejiga sana e identificamos modificaciones asociadas con el inicio y la progresión de condiciones patológicas (es decir, cistitis actínica y cáncer de vejiga). Usamos dos instrumentos basados ​​en indentación (un microscopio de fuerza atómica y un nanoindentador) y comparamos los mapas micromecánicos con un análisis histológico integral. Encontramos que la pared vesical sana es un tejido mecánicamente heterogéneo, con un gradiente de rigidez creciente desde el urotelio hasta la lámina propia, que va decreciendo progresivamente al alcanzar la capa externa del músculo. El endurecimiento de los tejidos fibróticos se correlaciona con un mayor depósito de matriz extracelular densa en la lámina propia. Se observa un aumento en la distensibilidad del tejido antes de la aparición e invasión del tumor. Al proporcionar una investigación micromecánica de alta resolución de cada capa de tejido de la vejiga, representamos la heterogeneidad mecánica intrínseca de las capas de una vejiga sana en comparación con las alteraciones de las propiedades mecánicas asociadas con la cistitis actínica o el tumor vesical.

La elasticidad y la viscosidad caracterizan las propiedades mecánicas de los tejidos blandos y desempeñan un papel fundamental en la definición de las funciones de las células y los tejidos, así como en el desarrollo de los tejidos, la progresión de la enfermedad y la homeostasis de los tejidos1,2,3. Cada órgano específico tiene propiedades mecánicas particulares, las cuales se alteran cuando se altera la homeostasis y se desarrollan enfermedades, como ocurre con los procesos de envejecimiento, el cáncer, la fibrosis, las enfermedades cardiovasculares y la diabetes4,5,6,7,8.

La vejiga es un órgano hueco que tiene que adaptarse y estirarse durante el llenado y vaciado, cuyas funciones se logran a través de ciclos de relajación mecánica y contractilidad. Las propiedades mecánicas de la vejiga han sido reportadas a nivel de macroescala9,10, incluyendo la caracterización de las diferentes áreas macroscópicas11. La alteración de las propiedades mecánicas de la vejiga da como resultado una disfunción de su función fisiológica, como ocurre con muchas patologías vesicales benignas que progresan desde la formación de una matriz más rígida a una estructura más flexible12. Se ha informado rigidez para enfermedades malignas de la vejiga, que se asoció con un alto contenido de fibras de colágeno en la MEC;13 además, se informó una mayor rigidez de la vejiga en pacientes con tumor recidivante14. Si bien estos estudios en muestras clínicas son muy informativos, muestran mediciones a macroescala y una instantánea de la situación clínica.

Este estudio se ha centrado en dos condiciones patológicas de la vejiga: la cistitis actínica y el cáncer de vejiga urotelial. La cistitis actínica es una condición patológica, que puede ser causada como secuela de la radioterapia pélvica, comúnmente utilizada para tratar el cáncer de próstata y recto15,16. La cistitis actínica es causada por la acumulación de proteínas de la MEC debido a la inflamación crónica, lo que resulta en cicatrización y engrosamiento del tejido y, potencialmente, en una falla orgánica terminal, con un impacto clínicamente relevante para los pacientes4.

El cáncer de vejiga es el noveno cáncer más común en todo el mundo17. Se origina mayoritariamente en el urotelio, y según la invasión de las diferentes capas de tejido se clasifica en cáncer de vejiga no músculo-invasivo (NMIBC) y cáncer de vejiga músculo-invasivo (MIBC). Según el sistema de clasificación TNM18, los TVNMI se subdividen en pTa y carcinoma in situ (Tis) cuando el tumor está presente en el urotelio, y pT1 cuando invade la lámina propia. Por el contrario, los MIBC se segregan en pT2 cuando el tumor alcanza la capa muscular, desde donde puede seguir migrando invadiendo los tejidos perivesicales (estadio pT3) y los órganos contiguos (estadio pT4), incluyendo así la próstata, el útero y otros19. La capacidad de las células cancerosas para invadir los tejidos adyacentes es un sello distintivo del cáncer y, en el caso del cáncer de vejiga, la invasión de la lámina propia20 o la capa muscular21 determina un manejo diferente. Las células de cáncer de vejiga del urotelio invaden el tejido como células individuales aisladas, cordones de células en un patrón de fila única o pequeños nidos22. La mayoría de los pacientes con TVNMI experimentan una recaída del tumor y, por lo tanto, se someten a múltiples ciclos de intervención representados por resección transuretral del tumor vesical (TURBT) y terapia adyuvante intravesical20. Eventualmente, si el tumor progresa e invade también la capa muscular, los pacientes pueden ser candidatos a cistectomía radical o tratamientos agresivos multimodales para intentar preservar el órgano21.

Las técnicas de imagen clínica pueden detectar la fibrosis establecida y los estadios iniciales del tumor, pero existe la necesidad clínica de identificar estadios de la enfermedad aún más tempranos y desarrollar un seguimiento más personalizado de la enfermedad para identificar signos muy iniciales de cualquier recaída de la enfermedad.

Comprender el vínculo entre las características micromecánicas y los fenotipos clínicos en las neoplasias malignas de vejiga puede contribuir a mejorar la clasificación pronóstica6. Además, este conocimiento puede contribuir al desarrollo de nuevas terapias basadas en la modificación de los controladores micromecánicos de la carcinogénesis6. Además, una comprensión profunda de las características mecánicas de una vejiga sana puede ser crucial para cualquier propósito de reconstrucción vesical, con el objetivo de desarrollar vejigas artificiales y mecánicamente distensibles15,23.

Motivados por la perspectiva a largo plazo de explotar el fenotipado mecánico de células y tejidos como una herramienta de diagnóstico temprano para el inicio y la progresión de enfermedades como el cáncer de vejiga urotelial, realizamos mediciones de fuerza frente a indentación para caracterizar el módulo de elasticidad de Young (YM). de los tejidos de la vejiga, espacialmente resueltos a microescala. Como la identificación de marcadores mecánicos para enfermedades debe basarse en protocolos e instrumentación simplificados para ser realizados en las clínicas, nuestra estrategia fue comenzar con una técnica ampliamente utilizada en mecanobiología, que es la microscopía de fuerza atómica (AFM) como referencia; y luego avanzar hacia el uso de un nanoindentador, que es un dispositivo de indentación más práctico y potencialmente fácilmente transferible a las clínicas para materia blanda.

Por lo tanto, el proyecto actual tuvo como objetivo i) caracterizar las propiedades elásticas estáticas de las tres capas de tejido que componen la pared de la vejiga sana a nivel de microescala; ii) identificar modificaciones asociadas con la aparición y progresión de condiciones patológicas (es decir, cistitis actínica y cáncer de vejiga); y, iii) asociar tales huellas dactilares mecánicas al estándar de oro del diagnóstico (es decir, examen histológico por uropatólogo experimentado).

La elasticidad de la vejiga murina se midió con dos instrumentos de microindentación: AFM y nanoindentador. La pared de la vejiga resultó ser mecánicamente heterogénea, con valores de cobertura de YM locales que van desde unos pocos kPa hasta cientos de kPa (Fig. 1a, b). Para identificar el origen de esta falta de homogeneidad mecánica, investigamos la existencia de una asociación entre la distribución YM y las diferentes capas anatómicas de la pared vesical. Al realizar la indentación basada en AFM focalizada en las capas de tejido único (Fig. 1a) se observó que el urotelio tenía un valor mediano de YM de 16 kPa, la lámina propia de 63 kPa y el músculo de 72 kPa (4,20, 4,80 y 4,86). respectivamente en Log10(YM/Pa)). En mapas micromecánicos de resolución espacial adquiridos con el nanoindentador, observamos que la pared vesical sana se caracterizaba por un gradiente de rigidez tisular (fig. 1b): el urotelio presentaba el YM más bajo (10 kPa), que aumentaba gradualmente al llegar al segundo tejido vesical capa, la lámina propia (100 kPa), y disminuyó transitoriamente al alcanzar la capa de tejido muscular externo (70 kPa) (Fig. 1b). Los instrumentos AFM y nanoindenter proporcionaron valores YM comparables para las diferentes capas de tejido de la vejiga, tanto en fisiología (Fig. 1c) como en patología (para una comparación completa de cada condición fisiológica y patológica y tres capas de tejido entre nanoindenter y AFM, se recomienda al lector a la figura complementaria 1). Por lo tanto, los siguientes resultados se derivan de los datos recopilados por duplicado utilizando AFM y nanoindenter.

un YM por AFM representado en logaritmo en base 10 (log10) en Pa para las diferentes capas de tejido vesical. b Valores de YM obtenidos con el nanoindentador. La heterogeneidad mecánica de la vejiga se correlaciona con su distribución anatómica: existe un gradiente de YMs, siendo el urotelio la capa más blanda, aumentando la rigidez al llegar a la lámina propia, y luego disminuyendo sobre las capas musculares. La asociación de los gradientes de rigidez con las capas de tejido vesical anatómico se muestra mediante la superposición del mapa mecánico con la tinción de hematoxilina-eosina. Los píxeles azules indican mediciones rechazadas. c Media de los valores medianos de la pared vesical de una rata sana ± SEM, extraídos por los dos instrumentos. AFM y nanoindenter proporcionan resultados comparables (la prueba Anova bidireccional no mostró diferencias estadísticamente significativas). Para una comparación completa entre nanoindentador y AFM, se remite al lector a la Fig. 4 complementaria. d Evolución de la rigidez de las diferentes capas de tejido de la vejiga (urotelio, lámina propia y músculo) con el envejecimiento del animal adulto (AFM y nanoindentador). datos reunidos). También se muestra la distribución de valores YM para todo el tejido (es decir, todas las capas juntas). N = 3 ratas por punto de tiempo, cada capa de tejido de cada rata individual se caracteriza por más de 3000 mediciones de la curva de fuerza. Los datos que se muestran son logaritmos en base 10 de YM (en Pa). e Media de los valores medianos de cada rata ± SEM. La prueba no paramétrica de Mann-Whitney no mostró diferencias estadísticamente significativas al comparar las diferentes capas de tejido en los puntos de tiempo estudiados. f Cuantificación del área de la vejiga que expresa colágeno de ratas de control en diferentes momentos; cada símbolo representa la medida en un corte de tejido, con varios cortes medidos para cada vejiga, en tres animales. Los datos de origen detrás de gráficos y cuadros se pueden encontrar en https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cistitis_and_tumor_presence/158222.

Con el fin de proporcionar una comparación precisa de la mecánica de la vejiga durante la progresión de la enfermedad en el modelo de rata versus animales sanos, aquí caracterizamos la evolución de la vejiga sana YM a lo largo del proceso de envejecimiento de los animales durante su vida adulta (es decir, desde los 4 meses de edad, que equivale a 2 meses post-tratamiento, a 8 meses, que corresponde a 6 meses post-tratamiento). El envejecimiento de los animales entre su vida adulta resultó en un endurecimiento general del tejido de la vejiga (Fig. 1d). De interés, centrándose en cada capa de tejido se confirmó tal tendencia. De hecho, el urotelio exhibió una distribución de valores muy amplia, que se desplazó hacia valores más altos con el envejecimiento: en el Mes 2 pudimos apreciar que el urotelio exhibió una distribución bimodal, que se movió hacia valores más altos en el Mes 6, y la población más rígida se enriqueció. Se pudo observar que el pico más alto de las distribuciones de urotelio se superponía con el pico de la lámina propia, lo que indica que los límites entre las diferentes capas de tejido están divididos por transiciones de rigidez, en lugar de límites de tejido drásticos y bien separados.

Del mismo modo, la lámina propia siguió la misma tendencia: en el Mes 2 la media de los valores de la mediana fue de 4,72 ± 0,2 Log10(YM/Pa), hasta 5,18 ± 0,25 Log10(YM/Pa) en el Mes 6 (Fig. 1e). Asimismo, YM aumentó con el envejecimiento también para el tejido muscular, y en el Mes 6 exhibió una distribución bimodal. Tal aumento de rigidez no se correlacionó con un aumento de colágeno dentro del tejido de la vejiga (Fig. 1f).

Los animales irradiados con rayos X que desarrollaron cistitis actínica se utilizaron como modelo para caracterizar las huellas dactilares mecánicas del tejido de la vejiga fibrótica (Fig. 2a). La irradiación de rayos X resultó en un aumento de la frecuencia de la micción y una disminución del volumen de orina por cada micción (Fig. 2 complementaria). Dicho efecto biológico se acompañó de alteraciones de la elasticidad: cistitis actínica inducida por irradiación como consecuencia de la fibrosis vesical y un depósito de MEC más denso, lo que por un lado resultó en un aumento de la rigidez de la pared vesical, pero por otro el gradiente de elasticidad dentro de la vejiga. la pared vesical se mantuvo (el urotelio se caracterizó por un YM más bajo, que aumentó sobre la lámina propia y disminuyó aún más al alcanzar la capa muscular externa) (Fig. 2b).

a Representación esquemática del experimento: se utiliza radioterapia de rayos X para inducir cistitis actínica en la vejiga. Las ratas se sacrifican en diferentes momentos y se evalúa la elasticidad del tejido. b Gradiente representativo de rigidez de la pared de la vejiga recogido con el nanoindentador en el mes 4: la radiografía provoca una rigidez de toda la pared de la vejiga en comparación con animales sanos no tratados. Las diferencias espaciales mecánicas dentro de la vejiga fibrótica se mantienen y se asocian a las diferentes capas de tejido (U: urotelio, L: lámina propia, M: músculo). c Cinética de YM de vejigas radiadas por rayos X en diferentes puntos de tiempo (rojo) y comparación con animales sanos de la misma edad (gris) medidos con nanoindentador y AFM. N = 3 ratas por punto de tiempo y condición, cada capa de tejido de cada rata individual se caracterizó por más de 3000 mediciones de la curva de fuerza. Los datos que se muestran son logaritmos en base 10 de YM (en Pa). d Veces del cambio de la media de los valores log10 YM medianos de las capas de tejido de las ratas tratadas con respecto a las ratas de control de la misma edad. La prueba T mostró una rigidez estadísticamente significativa con respecto a los animales de control (se muestra la media ± desviación estándar con el error propagado. ns = no significativo, * = valor de p < 0,05, ** = valor de p < 0,005). e Media de la mediana de los valores log10 YM de las capas de tejido de cada rata ± SEM. Anova de 2 vías no mostró diferencias estadísticamente significativas en la cinética del desarrollo de fibrosis. f) Cuantificación del área de la vejiga que expresó colágeno de ratas de control y animales irradiados con rayos X en diferentes puntos de tiempo; cada símbolo representa la medida en un corte de tejido, con varios cortes medidos para cada vejiga, en tres animales. Los datos de origen detrás de gráficos y cuadros se pueden encontrar en https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cistitis_and_tumor_presence/158222.

Para caracterizar la cinética de YM después de la irradiación, se analizó la elasticidad de la vejiga de los animales irradiados en diferentes momentos después del tratamiento y se comparó con la de animales sanos de la misma edad. Dos meses después del tratamiento, el urotelio fue el componente tisular que mayormente respondió a la irradiación, como se evidencia tanto al comparar la distribución del histograma de los datos (Fig. 2c), como el fold change de la media respecto a los controles (Fig. .2d). La lámina propia mostró una distribución ligeramente más estrecha en comparación con los controles de la misma edad (Fig. 2c), junto con una mayor deposición de colágeno con respecto a los animales control (Fig. 2f). La capa muscular no mostró diferencias en este momento.

Cuatro meses después del tratamiento de irradiación, el urotelio exhibió una gran variedad de módulos comparable al control de la misma edad (Fig. 2c). Por el contrario, tanto la lámina propia como las capas musculares parecían responder particularmente al proceso fibrótico: de hecho, ambas parecían más rígidas y más estrechamente distribuidas que sus contrapartes sanas (Fig. 2c). De manera similar, se observaron valores medios más altos en comparación con el punto de tiempo anterior (Fig. 2e). Al comparar la media de los valores medianos de las distribuciones con contrapartes sanas, la lámina propia y el músculo estaban más rígidos (Fig. 2d), rigidez asociada con una mayor deposición de colágeno en las vejigas fibróticas (Fig. 2f).

Al comparar el perfil YM del Mes 4 al Mes 6, las distribuciones no cambiaron significativamente hacia valores YM más altos (Fig. 2c), lo que sugiere que el daño permanece estable a lo largo del tiempo y no causa más rigidez en el punto temporal posterior (Fig. 2e ). De hecho, debido al envejecimiento fisiológico de la vejiga que produce rigidez, las diferencias entre los animales irradiados y los sanos fueron menos drásticas en los animales mayores, ya que el efecto del tratamiento probablemente quedó enmascarado por el envejecimiento de los animales y la rigidez solo se informó para el urotelio (Fig. 2d). La cuantificación de colágeno en el tejido de los animales irradiados mostró un aumento en la deposición de colágeno en comparación con los animales no tratados en el Mes 2 y el Mes 4, pero no en el Mes 6 (Fig. 2f). Sin embargo, los animales tratados de mayor edad exhibieron una distribución menos amplia, lo que sugiere que la disminución en la heterogeneidad de la rigidez fue causada por el reemplazo de los componentes del tejido por colágeno debido a una respuesta fibrótica.

Curiosamente, observamos que el perfil micromecánico de uno de los animales irradiados no mostró ningún efecto en términos de rigidez y fue comparable al de los animales control sanos de la misma edad (4 meses después del tratamiento) (Fig. 3a). Después de seguir el análisis histológico y la evaluación de la fibrosis, confirmamos que este animal específico no había desarrollado fibrosis vesical (Fig. 3b), destacando así el potencial de la microindentación para detectar la fibrosis causada por la irradiación, y demostrando que la microindentación no detectó rigidez en la ausencia del depósito histológico de MEC fibrótica.

a El perfil micromecánico (azul) fue comparable al de los tejidos sanos de control de la misma edad (4 meses después de la irradiación) (gris). b El análisis histológico mostró una deposición más densa de ECM (*) en un animal que respondió a los rayos X (izquierda) acompañada de un aumento de la rigidez. La histología de la vejiga sin rigidez (derecha) reveló ausencia de daño fibrótico (4 meses después de la irradiación). Los datos de origen detrás de gráficos y cuadros se pueden encontrar en https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cistitis_and_tumor_presence/158222.

Para estudiar el efecto del desarrollo y la progresión del tumor en la mecánica de la vejiga, se estudió la evolución de la elasticidad de la vejiga en un modelo de rata ortotópica, en el que las ratas se regaron con agua que contenía el carcinógeno nitrosamina (BBN) específico de la vejiga (Fig. 4a) . Este modelo permite monitorear todas las etapas del desarrollo y progresión del cáncer de vejiga, imitando así los procesos patológicos que ocurren en humanos.

a) Establecimiento modelo animal. Gradientes representativos de rigidez de la pared de la vejiga recogidos con nanoindentador en (b) 2 meses de tratamiento con BBN, donde la displasia de urotelio está marcada con *; (c) 4 meses de tratamiento con BBN, donde el tumor pTa limitado al urotelio sin invadir la lámina propia está marcado con **. Los tumores pT1 en los que las células tumorales uroteliales rompen la membrana basal e invaden la lámina propia por debajo a los 4 y (d) 6 meses de tratamiento con BBN están marcados con ***. U: urotelio, L: lámina propia, M: músculo. YM de vejigas tratadas con BBN (negras) a (e) 2 meses, (f) 4 meses y (g) 6 meses de tratamiento con BBN; y comparación con animales sanos de la misma edad (gris) medidos tanto con nanoindentador como con AFM. N = 3 ratas por punto de tiempo y condición, cada capa de tejido de cada rata individual se caracteriza por más de 3000 mediciones de la curva de fuerza. Los datos que se muestran son logaritmos en base 10 de YM (en Pa). h Pliegue de cambio de la media de los valores medianos log10 YM de las ratas tratadas ± desviación estándar (con error propagado) con respecto a las ratas control. La prueba T mostró un ablandamiento estadísticamente significativo con respecto a los animales de control (se muestra la media ± desviación estándar con el error propagado. ns=no significativo, *=valor de p < 0,05, **=valor de p < 0,005, ***=valor de p < 0,0005). i Media de los valores medianos de cada rata. Anova de 2 vías mostró que se observaron diferencias estadísticamente significativas en el modelo BBN en el urotelio del mes 2 al mes 4, y del mes 4 al mes 6; y para la lámina propia del mes 4 al mes 6. Los datos de origen detrás de los gráficos y las tablas se pueden encontrar en https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cistitis_and_tumor_presence/158222.

Después de 2 meses de tratamiento con BBN, los tejidos vesicales presentaban displasia de bajo grado, lo que significa que hay células epiteliales con la organización anormal (Fig. 4b). La presencia de células anormales se limitaba al urotelio, que aumentaba su grosor y celularidad, sin invadir la lámina propia por debajo. Además, el BBN activa vías de inflamación en la vejiga. En esta etapa, los tejidos vesicales displásicos se caracterizaron por alteración de la elasticidad del urotelio, lo que se correlacionó con el ensanchamiento de la capa celular y la presencia de células anormales (Fig. 4b, e). La lámina propia y las capas musculares exhibieron perfiles YM equivalentes a los de los animales de control de la misma edad, y el tejido general no difirió significativamente del tejido de la vejiga sana.

Después de 4 meses de tratamiento con BBN, los tejidos vesicales mostraban tumores no invasivos localizados en el urotelio (pTa), y había pocos puntos de invasión focal en los que pocos grupos de células invadían superficialmente la lámina propia por debajo (pT1) (Fig. 4c). ). Estos tejidos vesicales mostraron un ablandamiento en el urotelio en comparación con los controles (Fig. 4f) de 0,81 veces de cambio (Fig. 4h), así como en la lámina propia que exhibió una distribución de rigidez muy amplia (0,78 veces de cambio). Se pudo apreciar que la distribución de la elasticidad del músculo comenzó a cambiar ligeramente hacia valores más bajos de YM en comparación con el músculo sano, con un cambio de 0,87 respecto al tejido muscular de control, a pesar de que las células cancerosas aún no invadían esta capa de tejido. La distribución YM de todo el tejido se caracterizó por un perfil bimodal: un pico más bajo que correspondía a la presencia de células tumorales en el urotelio y en la lámina propia, y un pico más rígido que correspondía a la capa de tejido muscular sin presencia de células tumorales , que se superpone parcialmente con el tejido sano (Fig. 4f).

Después de 6 meses de tratamiento con BBN, las células tumorales estaban presentes en la lámina propia (pT1) (Fig. 4d). Además, en este momento, las vejigas tratadas se caracterizaron por cambios en las distribuciones de elasticidad hacia valores más suaves para el urotelio y la lámina propia (Fig. 4g). El tejido muscular exhibió una distribución bimodal con un pico desplazado hacia valores más bajos y un segundo pico que se superponía con los de la vejiga sana (Fig. 4g). Probablemente debido al envejecimiento fisiológico de los animales que conduce a un aumento en la elasticidad del tejido, el cambio de pliegue con respecto a los controles fue menos dramático, siendo la lámina 0,93 más suave y el músculo 0,90 más suave (Fig. 4h). Presumimos que el principal contribuyente a este ablandamiento de la vejiga era la presencia de células tumorales dentro del tejido, que se sabe que son más blandas que sus contrapartes sanas. No obstante, se detectó reblandecimiento de las diferentes capas previo a la invasión de células tumorales (para lámina y músculo a los 4 meses, y para músculos a los 6 meses). En general, el microambiente neoplásico fue más suave que el de los animales sanos, incluso cuando dicho efecto suavizante se combinó con el envejecimiento fisiológico de estos animales.

Una vez que estudiamos la mecánica del tumor vesical en un modelo murino que permite un seguimiento más cercano de los tumores en etapas más tempranas, caracterizamos el perfil micromecánico de un MIBC de alto grado de un paciente que se sometió a una cistectomía radical. En este contexto, investigamos muestras quirúrgicas pareadas que incluían el tejido muscular infiltrado por células neoplásicas y el tejido muscular no invadido. Esta estrategia permite caracterizar tejido neoplásico vs no neoplásico, pero evitando la variabilidad entre donantes. El tejido muscular normal se caracterizó por un YM que siguió aproximadamente una distribución gaussiana después de la transformación logarítmica, con un valor medio de 3,52 Log10(YM/Pa) (33 kPa en escala lineal), mientras que la infiltración neoplásica de células tumorales en el tejido muscular resultó en un aumento de la heterogeneidad mecánica y un reblandecimiento global del tejido (valor medio de 3,28 Log10(YM/Pa), 2 kPa en escala lineal) (fig. 5).

a Tinción con hematoxilina-eosina de cáncer de vejiga invasivo de músculo y tejido muscular no neoplásico emparejado de un paciente con carcinoma urotelial de alto grado. b Perfil mecánico del tejido muscular neoplásico (naranja) y no neoplásico (azul) del mismo paciente (n = 1). Datos recogidos con el nanoindentador. Los datos se muestran como logaritmos en base 10 de YM (en Pa). Los datos de origen detrás de gráficos y cuadros se pueden encontrar en https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cistitis_and_tumor_presence/158222.

Este estudio detalla la mecánica de las tres capas de tejido de la vejiga a nivel de microescala, revelando así la heterogeneidad en términos de elasticidad de las tres capas de tejido, rigidez del tejido para la cistitis actínica y ablandamiento de las tres capas durante el inicio y la progresión del cáncer de vejiga. Al proporcionar una caracterización mecánica a nivel de microescala, aquí proporcionamos información novedosa sobre los cambios en el entorno neoplásico según la forma de invasión del cáncer de vejiga que es por células individuales o pequeños grupos de células.

Hasta donde sabemos, en este estudio realizamos el primer mapeo micromecánico espacial y temporal de toda la pared de la vejiga, con resolución espacial a nivel de micras, tanto en condiciones de salud, cistitis actínica y cáncer de vejiga. La metodología utilizada aquí fue primero AFM, el estándar de oro en mecanobiología para investigar la mecánica celular. No obstante, la investigación de las propiedades mecánicas de los tejidos debe abordar regiones de muestreo más grandes, lo que significa una mayor escala de prueba, rugosidad de la superficie y heterogeneidad mecánica de la muestra. Esto requiere, en primer lugar, un mayor rango piezoeléctrico Z y, en segundo lugar, un bucle de indentación cerrado para medir todas las heterogeneidades mecánicas (para sondear regiones muy blandas y muy rígidas dentro de un área de muestreo grande). Por otro lado, se ha informado anteriormente que la investigación de la mecánica basada en nanoindentación sufre problemas de replicación, que se han superado a escala celular24, pero aún no a escala tisular. Por lo tanto, con el objetivo de superar los desafíos técnicos de probar muestras tan complejas y aumentar la solidez y la reproducibilidad de nuestros resultados, así como su eventual traducción a las clínicas, aquí combinamos dos instrumentos basados ​​en indentación: AFM y un nanoindentador, que supera tales tecnicismos y permitió la validación de nuestros propios datos.

Demostramos que la pared de la vejiga es un tejido heterogéneo altamente mecánico, caracterizado por un gradiente de rigidez desde el urotelio hasta la lámina propia y la capa muscular. También mostramos un efecto del envejecimiento sobre la mecánica tisular, que se sabe que altera la histología de la vejiga murina25. Comprender la mecánica tisular y la distribución correspondiente a las diferentes capas anatómicas del tejido, como se informó anteriormente para órganos como la córnea26 o la piel27, también es relevante para la vejiga, ya que su función fisiológica comprende alta tensión elástica y estrés mecánico, y puede ser crucial para la reconstrucción de la vejiga.

La fibrosis resulta de la acumulación patológica de proteínas de la MEC debido a la inflamación crónica, lo que resulta en cicatrización y engrosamiento del tejido y, finalmente, en falla orgánica15. Utilizamos la irradiación de rayos X para establecer un modelo animal de cistitis actínica, con el fin de caracterizar las huellas dactilares mecánicas del tejido fibrótico de la vejiga. Mediante el uso de la representación del histograma del YM, identificamos la rigidez del urotelio 2 meses después de la irradiación, lo que sugiere que el efecto principal de la irradiación fue sobre las células, que es bien conocido por inducir la apoptosis celular28, y se informó previamente que las células apoptóticas son más rígido29. En el segundo momento estudiado, es decir, a los 4 meses, se produjo un endurecimiento de la lámina propia y del músculo, de acuerdo con un estudio previo30. El YM en el animal irradiado de 6 meses no cambió en comparación con el animal tratado de 4 meses, mientras que la mecánica de la vejiga en el animal de control aumentó de 4 a 6 meses de edad, enmascarando el efecto del tratamiento.

La investigación de la elasticidad del tejido por microindentación también pudo detectar la ausencia de fibrosis vesical en un animal irradiado que no desarrolló cistitis actínica. Esta información apoya el potencial diagnóstico de cuantificar la elasticidad tisular a microescala, lo que podría utilizarse para tener información más detallada sobre el estroma reactivo característico de los procesos fibróticos, que suele investigarse mediante técnicas histológicas.

También observamos un aumento en la distensibilidad del tejido en presencia de tumor de vejiga, tanto en el modelo de rata como en humanos, similar a lo que se ha informado para los tejidos de cáncer de hígado31. En principio, esta observación puede parecer controvertida y contraria a la tendencia general de los tumores sólidos (es decir, cáncer de mama32 y de pulmón33, dominados por la invasión celular colectiva34), donde suele producirse rigidez. También se observa rigidez tisular al estudiar órganos urológicos como la próstata o los testículos mediante técnicas no invasivas a macroescala4. Sin embargo, al proporcionar mapas micromecánicos resueltos espacialmente, aquí pudimos medir la contribución a la elasticidad del tejido tanto de las células como de la MEC. En el tumor MIBC encontramos un aumento en la heterogeneidad de la elasticidad del tejido cuando el tejido es invadido por células neoplásicas, como se informó previamente para el cáncer de mama32. Además, se ha establecido previamente que las células tumorales son más blandas que sus contrapartes benignas y que el ablandamiento de las células cancerosas aumenta con el aumento de la malignidad35.

Por otro lado, el endurecimiento de la ECM se reconoce cada vez más como una señal mecánica importante, que altera el comportamiento celular y en parte confiere capacidades distintivas a las células cancerosas, incluido el crecimiento sostenido, la invasión y la metástasis36. Dicho aumento de la rigidez de la MEC se asocia principalmente al aumento del depósito de colágeno37,38, especialmente en el frente invasivo de los tumores, que además suele corresponder a la región más rígida del tejido tumoral39. Un ejemplo de estroma fibrótico tumoral es el caso del cáncer de mama, en el que los tumores de mama se caracterizan por un mayor depósito de colágeno junto con una mayor linealización y engrosamiento de las fibras de colágeno40,41. Se sabe que aquellos tumores caracterizados por depósito de estroma fibrótico son más rígidos, como los de mama y páncreas42. Además, se ha informado para pacientes con NMIBC una asociación con COL1A1 y COL1A243. Por lo tanto, eventualmente sería interesante estudiar los tejidos vesicales descelularizados para investigar la contribución de la ECM a la rigidez de todo el órgano y estudiar las eventuales asociaciones con el aumento en la expresión de colágeno informado en pacientes con cáncer de vejiga sin invasión muscular con mal pronóstico43.

Además, en los tumores de vejiga, las células cancerosas migran como células individuales o pequeños nidos33, a diferencia de los tumores en los que se informa rigidez, por ejemplo, cáncer de mama, próstata y pulmón33. La invasión unicelular se puede dividir en migración mesenquimatosa y ameboidea33. Pocos estudios han demostrado que el cáncer de vejiga con invasión muscular promueve una mayor contractilidad de las células mediante la migración ameboidea, que, a diferencia de la migración mesenquimatosa, tiene lugar cuando la matriz circundante es relativamente blanda44. Al investigar los perfiles de elasticidad del tumor de vejiga en el modelo de rata, detectamos un ablandamiento en esas capas de tejido debajo del tumor cuando el tumor aún no invadía. Estos resultados indican que las capas de tejido experimentan una remodelación mecánica y se preparan antes de que sean invadidas por las células tumorales, lo que destaca el potencial clínico de medir la elasticidad del tejido mediante microindentación para el pronóstico temprano del cáncer de vejiga. Esta observación concuerda con un estudio previo, que informa que la remodelación mecánica del tejido que rodea las células neoplásicas precede a la invasión en esferoides de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello45. Se necesitan más pruebas en muestras clínicas para validar la información aquí obtenida mediante la investigación de la mecánica tisular utilizando un modelo preclínico.

Una limitación de nuestro estudio es que las muestras de vejiga se congelaron rápidamente antes de las mediciones mecánicas. Aunque no se realizó ningún tratamiento químico y las muestras se consideraron frescas/congeladas, no se puede excluir que el procedimiento de congelación/descongelación pueda incluir algún artefacto en las muestras, lo que aumenta la posibilidad de sesgos de selección. Con el objetivo de reducir este efecto, utilizamos un crioprotector (OCT) que protege la muestra de la formación de cristales de hielo y utilizamos un protocolo de congelación instantánea. Además, aquí realizamos un estudio comparativo entre diferentes condiciones, por lo que las muestras siempre se sometieron a un protocolo idéntico. Estudios previos han mostrado poco impacto en las propiedades mecánicas del tejido congelado46. Sin embargo, trabajar con tejidos congelados tiene varias ventajas, y diferentes estudios de AFM utilizaron muestras clínicas frescas congeladas27,47,48,49,50. Además, el tejido congelado permite preparar secciones semifinas, lo que permite el análisis histológico y la correlación con el examen histológico.

Otra limitación de nuestro trabajo tiene que ver con el modelado mecánico: al estimar las propiedades elásticas, despreciamos los efectos viscosos. Asumimos que los valores que informamos pueden considerarse característicos de una respuesta de material de baja frecuencia, donde los efectos viscosos juegan un papel insignificante. Sin embargo, el módulo de Young solo da una idea parcial de la respuesta mecánica del material. Por ejemplo, un trabajo reciente51 destacó cómo las diferentes cantidades de colágeno afectan tanto la rigidez como la viscosidad de los tejidos en los agregados celulares. Los estudios futuros deberían centrarse en la caracterización de los efectos viscoelásticos específicos de la capa.

Este estudio destaca la heterogeneidad mecánica intrínseca de las diferentes capas de la vejiga. Al proporcionar mapas micromecánicos de alta resolución, que representan las tres capas anatómicas de la vejiga, informamos una alteración de las propiedades mecánicas del tejido de la vejiga en las condiciones patológicas de la cistitis actínica y el tumor. Tales huellas dactilares mecánicas podrían finalmente allanar el camino para futuras herramientas de diagnóstico y pronóstico clínico, y también establecer posibles pistas para la reconstrucción de la vejiga.

Se manipularon ratas hembra Fischer de acuerdo con el protocolo ético #1114. Para inducir un estrés de estiramiento fisiológico de la vejiga, se realizaron imágenes de ultrasonido (US) antes de sacrificar a los animales para inferir el volumen de instilación que corresponde a una vejiga fisiológicamente estirada (Fig. 6 y Fig. 3 complementaria). Las imágenes de EE. UU. se realizaron en una estación de imágenes Vevo3100 LAZR-X equipada con un transductor MX250D (FUJIFILM VisualSonics, Ámsterdam, Países Bajos). La señal de US se recogió adquiriendo secciones axiales de la vejiga de rata utilizando los siguientes ajustes: frecuencia: 21 MHz; ganancia: 15 dB; tamaño de paso: 200 µm. Las imágenes de ultrasonido 3D en modo B de la vejiga de la rata se adquirieron y analizaron con el software VevoLab 3.2.5.

Protocolo de preparación de muestras y tubería de experimentos. En primer lugar, se realizan imágenes de ultrasonido (US) para determinar el volumen fisiológico de instilación vesical del crioprotector OCT. Luego se sacrifican los animales, se instila el crioprotector en la vejiga a través de un catéter y luego se explanta y congela la vejiga. Se preparan criosecciones y se realizan experimentos de microindentación en los portaobjetos de tejido tanto por AFM como por nanoindentador. Posteriormente, se realizó un análisis histológico para confirmar la ubicación de las capas anatómicas de la vejiga.

Se alojaron ratas Fisher hembra de 150–175 gramos (Charles River, Alemania) de dos meses de edad en las instalaciones para animales del Hospital IRCCS San Raffaele en condiciones estándar (temperatura: 22 °C ± 2; humedad: 50 ± 10 %; luz/oscuridad). ciclo: 12 h luz y 12 h oscuridad). Después de un período de aclimatación de 1 semana, las ratas se irradiaron con rayos X. Los animales fueron anestesiados con isofluorano al 2-4% 0,3-0,8 L y la vejiga se llenó con 450 µl de solución salina estéril a través de un catéter PE5052. La vejiga se irradió con una muestra única de 20 Gy. La dosis de radiación se administró utilizando un microirradiador dedicado para animales pequeños (X-RAD225Cx SmART, PXI North Branford, CT, EE. UU.) con guía de tomografía computarizada de haz de microcono (CBCT). Las ratas anestesiadas se colocaron boca abajo en el escenario del animal y las imágenes CBCT se adquirieron utilizando los siguientes ajustes: voltaje del tubo = 40 kVp, corriente = 5 mA, tamaño de vóxel = 0,2 mm3. Se contorneó la vejiga en la tomografía computarizada y se colocaron tres haces de dosis de igual tamaño en ángulos de 130°, 180° y 230° respectivamente, usando un colimador de 10 × 10 mm2. La distribución de dosis se calculó mediante un algoritmo de Monte Carlo53 y la dosis media en vejiga se ajustó a la dosis prescrita de 20 Gy. Los ajustes de irradiación fueron: voltaje del tubo = 225 kVp, corriente = 13 mA. El tiempo de entrega osciló aproximadamente entre 2 y 5 min/campo y todo el procedimiento (TC y radioterapia) se realizó en 20-25 min/animal. A continuación, se sacrificaron las ratas 2, 4 y 6 meses después de la radioterapia (3 ratas por estado) y se prepararon las vejigas para pruebas histológicas y mecánicas.

Se alojaron ratas Fisher hembra de dos meses (Charles River, Alemania) en las instalaciones para animales del Hospital IRCCS San Raffaele en condiciones estándar (temperatura: 22 °C ± 2; humedad: 50 ± 10 %; ciclo de luz/oscuridad: 12 h). luz y 12 horas de oscuridad). Después de un período de aclimatación de 1 semana, las ratas se dividieron uniformemente en dos grupos: un grupo (tumor) que se regó con N-(4-hidroxibutil)nitrosamina al 0,05 % (BBN; Sigma Aldrich) y el segundo grupo (control) regado con agua normal. A continuación, se sacrificaron las ratas 2, 4 y 6 meses después del inicio del tratamiento (3 ratas por condición) y se prepararon vejigas para pruebas histológicas y mecánicas.

Todos los procedimientos y estudios con animales se realizaron según los protocolos aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales del IRCCS Ospedale San Raffaele, y de acuerdo con las pautas estándar nacionales e internacionales.

Se obtuvieron muestras pareadas de tejido no neoplásico y carcinoma urotelial de vejiga de un paciente (varón, 62 años, con MIBC-pT2 G3) a través de la Unidad de Patología del IRCCS Ospedale San Raffaele (Milán, Italia). Se obtuvo un consentimiento formal por escrito de la Junta de Revisión Institucional local (Comité de Ética IRCCS Ospedale San Raffaele; versión modificada del protocolo URBBAN aprobada en noviembre de 2020). La recopilación de datos y todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética IRCCS Ospedale San Raffaele, de acuerdo con las pautas y regulaciones relevantes descritas en la Declaración de Helsinki. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado por escrito aceptando proporcionar su propia información anónima para este y futuros estudios.

Para los especímenes de rata, se realizaron imágenes de ultrasonido de vejiga para caracterizar el volumen de instilación que causa un estiramiento fisiológico de la vejiga. Luego, los animales fueron sacrificados con CO2 y mediante cateterismo vesical (cánula de 22 G, BD, Italia) se instiló en la vejiga el crioprotector OCT (Bio-Optica, IT) (volumen previamente definido por imágenes de EE. UU., que oscila entre 200 y 400 µl según tamaño y capacidad de estiramiento de cada vejiga) (Fig. 6). Se cerró la uretra y se explantó la vejiga. Para preservar la integridad de la muestra, las vejigas se congelaron instantáneamente en medio de inclusión de tejido (Compuesto OCT para seccionamiento criostato) a -80 °C (isopentano y hielo seco)54. Los especímenes humanos se congelaron de la misma manera.

Para el análisis mecánico, se prepararon secciones de tejido de 50 µm de espesor utilizando un criostato de microtomo, y las secciones recién congeladas se descongelaron a temperatura ambiente en portaobjetos de vidrio superfrost polarizados para inmovilizarlos para mediciones mecánicas. La OCT se eliminó con un lavado con solución tampón de fosfato (PBS) antes de la prueba mecánica. Se descongelaron secciones congeladas emparejadas de 10 µm de espesor, se fijaron con formalina y se tiñeron con hematoxilina-eosina para análisis histológicos completos.

El módulo de Young (YM) de las muestras de tejido vesical se caracterizó utilizando el nanoindentador Chiaro (Optics11) y el Bioscope Catalyst AFM (Bruker). Si bien ambos instrumentos brindan resultados similares en términos de valores de YM medidos, la principal diferencia entre las dos técnicas reside en el aparato utilizado para medir la fuerza aplicada a la muestra (Fig. 7).

La principal diferencia entre ambos instrumentos de indentación es el rango piezoeléctrico z, la detección de la desviación del voladizo y el parámetro fijo durante las mediciones.

Los valores del módulo de Young de las diferentes capas del tejido de la vejiga se determinaron ajustando el modelo de Hertz55,56 a conjuntos de curvas de fuerza versus indentación (simplemente curvas de fuerza, FC) adquiridas por AFM en secciones de tejido de 50 µm de espesor, como se describe en otra parte24,57, 58, que es precisa siempre que la muesca δ sea pequeña en comparación con el radio R:

En la ecuación. (1), ν es el coeficiente de Poisson, que normalmente se supone que es igual a 0,5 para materiales incompresibles, y E es el módulo de Young.

Sondas de vidrio de borosilicato monolíticas personalizadas que consisten en perlas de vidrio esféricas (SPI Supplies), con radios R en el rango de 5 a 10 µm, se unieron a voladizos sin punta (Nanosensor, TL-FM) con constante de resorte nominal k = 3–5 N/ metro. Las sondas se fabricaron y calibraron, en términos de radio de punta, de acuerdo con un protocolo personalizado establecido59. Las variaciones en el radio de contacto se debieron a la disponibilidad técnica de las sondas individuales durante las mediciones ya las variaciones internas de las perlas de vidrio (dentro del mismo lote) utilizadas para la fabricación de las sondas coloidales. La constante de resorte del voladizo se midió utilizando el método de calibración de ruido térmico60,61 y se corrigió por la contribución de la masa añadida de la esfera62,63. La sensibilidad de deflexión se calibró in situ y de forma no invasiva antes de cada experimento utilizando como referencia la constante de resorte previamente caracterizada, según el procedimiento SNAP24.

Todas las mediciones mecánicas se han realizado con muestras de tejido sumergidas en solución de PBS. Se recopilaron conjuntos de FC (volúmenes de fuerza o FV) en regiones seleccionadas de interés identificadas explotando la alineación precisa de imágenes ópticas y AFM obtenidas utilizando el módulo de software Miro integrado en el software AFM. El acceso óptico y el diseño de los cortes de tejido permitieron mover la sonda directamente sobre las diferentes capas de la vejiga (urotelio, lámina propia, capa muscular) y localizar las regiones de interés para analizar las propiedades mecánicas locales.

Cada FV generalmente constaba de una matriz de 144 a 225 FC, separados espacialmente por 5 a 10 μm, cada FC con 8192 puntos, con longitud de rampa L = 6 a 10 μm, carga máxima Fmax = 200 a 1500 nN y frecuencia de rampa f = 1 Hz. La carga máxima se ajustó para lograr una muesca máxima típica en el rango de alrededor de 2 a 5 μm. La velocidad típica de aproximación de la sonda durante la sangría fue de 12 a 20 µm/s.

Cada capa de tejido se caracterizó mediante la recogida de al menos 15 FV independientes en diferentes regiones de interés separadas macroscópicamente en tres cortes de tejido diferentes para cada rata (es decir, para cada órgano vesical diferente). Se seleccionaron portaobjetos de tejido de la región media de la vejiga para normalizar el grosor de la pared de la vejiga (la sección transversal de la vejiga más cercana a los extremos de la vejiga tiene una capa muscular más gruesa). Además, para evitar el sesgo debido al muestreo de un área particular de la vejiga, elegimos aleatoriamente al menos cuatro ubicaciones dentro de cada sección de tejido investigada para muestrear las tres capas de tejido, tomando como referencia los cuatro puntos cardinales de la sección de tejido. En total, cada capa se ha caracterizado por más de 2000 FC por órgano individual. El análisis de datos se realizó como se describe anteriormente en otro lugar64.

Después de la prueba mecánica, las secciones de tejido se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 % y se realizó una tinción con hematoxilina-eosina en el mismo corte para proporcionar una confirmación retrospectiva de la ubicación anatómica de cada región de interés medida durante el experimento de nanoindentación ( Figura 6).

Se recolectaron mapas mecánicos en vejigas murinas utilizando un nanoindentador Chiaro (Optics11 BV) en al menos tres áreas bien separadas en cada corte recolectado. En cuanto a las dimensiones, se eligió un tamaño de píxel de 10 µm con una dimensión total del mapa de 100 µm en la dirección tangencial (a través de las diferentes capas), y la longitud necesaria para cubrir todo el grosor de la pared de la vejiga, desde el urotelio hasta el músculo ( típicamente unos pocos 100 s de µm).

La caracterización mecánica de muestras de vejiga humana se realizó con el mismo nanoindentador Chiaro. Se recogieron mapas de hasta 1 mm por 1 mm (tamaño de píxel de 10 µm) en las tres capas de tejido diferentes de dos piezas de tejido diferentes por vejiga. Se midieron de tres a cinco portaobjetos de tejido por pieza de tejido. El modelo de Hertz (Ec. 1) se ajustó a las curvas de fuerza.

Los tejidos se probaron utilizando voladizos con una constante de resorte de ~0,5 N/m y un radio de ~9 µm. Todas las mediciones se realizaron en el modo de control de sangría (es decir, en un bucle cerrado para que la tasa de sangría sea constante durante toda la fase de carga), con una tasa de sangría de 5 µm/s y una sangría objetivo de 5 µm; en cuanto al caso de AFM, esta elección también se hizo para cumplir tanto con la aproximación del indentador parabólico de la teoría hertziana como para evitar el efecto de fondo dado por el grosor finito de la muestra65,66.

Para establecer la profundidad de indentación óptima, se compararon los YM obtenidos en diferentes rangos de indentación y se analizó la rugosidad de la superficie mediante perfilometría óptica (Veeco WYKO NT9100 y OCT, (Fig. 4 complementaria). Estas últimas técnicas mostraron una rugosidad dependiente de la escala. , con valores de rugosidad aritmética de alrededor de 2–300 nm cuando se analizaron áreas de radios de ~10 µm (es decir, la escala del contacto de la esfera del indentador). primera parte del contacto. Consideramos que un ajuste era válido cuando R2 era > = 0.90. También comparamos los resultados de ajuste para diferentes rangos de profundidad de indentación (1–3 µm, 3–5 µm): observamos que a diferentes profundidades de indentación, el YM se mantuvo casi igual, con un ligero aumento en el número de ajustes rechazados a medida que aumentaba la profundidad de la sangría (Figura 5 complementaria), lo que sugiere un comportamiento no lineal leve en deformaciones más grandes. Optamos por limitar el análisis a sangrías poco profundas ( 0.2–1.2 µm) para mantener resultados más consistentes y comparar más fácilmente los resultados con el conjunto de datos AFM; esta elección también aseguró que la muesca máxima fuera significativamente mayor que el valor típico de rugosidad.

Se prepararon criosecciones de vejiga de 10 µm de espesor, se lavó la OCT con PBS y se fijaron portaobjetos de tejidos en PFA al 4 %. Luego se realizó la tinción con hematoxilina eosina (HE) de la siguiente manera; los portaobjetos se lavaron dos veces con agua MilliQ y los núcleos celulares se tiñeron con hematoxilina durante 50 segundos, luego se lavaron durante 5 min en agua MilliQ y se incubaron con eosina durante 15 segundos. Después del lavado, los portaobjetos de tejido se deshidrataron en un gradiente creciente de etanol y luego se incubaron en xileno como agente de limpieza. A continuación, las muestras se montaron con Eukit. Nuestro uropatólogo experimentado (RL) realizó a ciegas un análisis histopatológico exhaustivo de los portaobjetos HE con respecto a los datos mecánicos. Además, se fijaron los mismos cortes de tejido utilizados previamente para mediciones mecánicas (50 µm de grosor) y se tiñeron con HE para confirmar las capas de tejido (20 segundos de hematoxilina y 15 segundos de eosina).

La cuantificación de colágeno de tejidos teñidos con HE se realizó mediante la cuantificación de la birrefringencia de colágeno a partir de imágenes adquiridas con luz polarizada en un microscopio de campo oscuro (Zeiss AxioImager M2M). Todas las imágenes se capturaron con un objetivo 10X (APOCHROMAT 10X - NA 0. 4 5) y se analizaron con el software ImageJ. Las imágenes primero se transformaron en imágenes de 8 bits, el umbral se ajustó manualmente para eliminar el ruido de fondo y recopilar todos los píxeles positivos del tejido. Se cuantificó el porcentaje de fracción de área por encima del umbral establecido.

Se calculó el valor medio de YM por capa de tejido y rata. Dado que los instrumentos AFM y nanoindenter proporcionan valores YM comparables y las curvas de fuerza se miden conceptualmente de la misma manera, los resultados informados aquí representan datos por duplicado recopilados tanto por AFM como por nanoindenter, y valores medianos obtenidos por ambos instrumentos por rata y capa de tejido. .

Con el fin de analizar el efecto de la irradiación de rayos X y el tratamiento con BBN en cada capa de tejido, calculamos la mediana de los cambios en los pliegues de YM con respecto a las ratas sanas. Para hacerlo, primero promediamos el AFM de cada rata y el valor medio de YM del nanoindentador para cada capa de tejido en un punto de tiempo específico. Esto da 3 valores medianos (uno por rata), en cada una de las condiciones estudiadas. Dado que estábamos interesados ​​en los cambios (mecánicos) como consecuencia de una enfermedad, emparejamos animales tratados/control. Como cada rata medida era un punto final, asumimos que cualquier condición de enfermedad podría originarse en cualquiera de las ratas sanas. Esto significa que los posibles cambios de pliegue por condiciones son las combinaciones de 3 ratas de control y 3 tratadas por punto de tiempo;

(C = control, T = tratado)

Rata1T/Rata1C, Rata2T/Rata1C, Rata3T/Rata1C,

Rata1T/Rata2C, Rata2T/Rata2C, Rata3T/Rata2C,

Rata1T/Rata3C, Rata3T/Rata3C, Rata3T/Rata3C.

Esto da 9 números por tratamiento y punto de tiempo. Si restamos 1 (sin cambio de pliegue de las ratas de control) de cada uno, podemos probar la distribución resultante con una prueba t de 2 vías para verificar la hipótesis de que tiene una media distinta de cero.

Para estudiar la cinética del tratamiento, se realizó Anova bidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey, comparando la media de los valores medianos de YM de cada capa de tejido de cada rata individual en los diferentes puntos de tiempo. Verificamos la normalidad de las distribuciones YM realizando gráficos de cuantil-cuantil (QQ) por rata y capa de tejido para ambos instrumentos. Para aquellas distribuciones YM que no presentaban una distribución normal, se realizó una prueba estadística no paramétrica (prueba de Mann-Whitney).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de origen detrás de gráficos y tablas se pueden encontrar en https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cistitis_and_tumor_presence/158222. Los datos de origen se incluyen en los datos complementarios 1–9. Cualquier información restante se puede obtener del autor correspondiente a petición razonable.

Código disponible del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos a H. Holuigue y E. Lorenc por su apoyo en las mediciones de AFM. Esta investigación fue financiada por el programa de investigación e innovación Horizon 2020 de la Unión Europea, bajo el acuerdo de subvención de la Acción Marie Skłodowska-Curie No. 812772 (proyecto Phys2Biomed) y recibió fondos del programa de investigación e innovación Horizon 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención 801126 (EDIT ).

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Unidad de Patología, Hospital IRCCS San Raffaele, Milán, 20132, Italia

R. Luciano

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Conceptualización, LMV, AP, MA; Metodología, LMV, MC, AP, MB, EA, IL, FP, CV, RL; Análisis formal, LMV, MC, MB, CV, AP, MA; Investigación, LMV, MC, MB; Recursos, MA, AP, PM; Curación de datos, LMV, MC, MB, AP, MA; Redacción-borrador original, LMV, MA; Revisión y edición de escritura, LMV, MC, MB, EA, FP, CV, PM, KB, AS, AP, MA; Adquisición de fondos, MA, PM; Supervisión, MA

Correspondencia a A. Podestà o M. Alfano.

MB y KB trabajan en Optics11 BV Todos los demás autores declaran no tener intereses en conflicto.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Alexander Cartagena-Rivera y Eve Rogers. Los informes de los revisores están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Martínez-Vidal, L., Chighizola, M., Berardi, M. et al. Huellas dactilares micromecánicas del cambio de vejiga de rata en presencia de cistitis actínica y tumor. Comun Biol 6, 217 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04572-0

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Recibido: 19 Agosto 2022

Aceptado: 09 febrero 2023

Publicado: 24 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04572-0

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